Molekylärdiagnostik

På denna sektion använder man sig främst av PCR-diagnostik som är en molekylärbiologisk metod som bland annat används för att söka efter sjukdomsalstrande smittämnen i provmaterial.

Förkortningen PCR står för Polymerase Chain Reaction, polymeraskedjereaktion, och man kan på ett förenklat sätt säga att man med PCR-metoden letar upp nålen i höstacken och bygger en ny stack av nålar.

Hur fungerar pcr

Analysprincipen bygger på att man spårar ett smittämnes arvsmassa, DNA/RNA, genom att blanda korta snuttar av specialdesignat DNA, så kallade primers, med provet tillsammans med en mix av kemikalier och nukleotider, DNA-byggstenar. Om smittämnet finns i provet kommer dessa primers att fungera som målsökande robotar som söker upp och fäster vid två punkter på smittämnets arvsmassa. Primrarna fungerar sedan som startpunkter för ett enzym, DNA-polymeras, som, med hjälp av kemikaliemixen, kopierar den mellanliggande DNA-strängen till dess att en tillräckligt stor mängd kopior har skapats för att de ska kunna mätas. Kopieringsprocessen sker i ett förprogrammerat temperaturprogram i en PCR-maskin.

Som metod simulerar PCR i någon mån cellens sätt att vid celldelning göra nya kopior av kromosomernas DNA-kedjor, men man har ersatt en stor mängd enzymer med en cykel av temperaturväxlingar. Det enda enzym som behövs är själva polymeraset. Förutsättningen för en PCR-analys är en bestämd frågeställning, det vill säga man måste veta vad man letar efter, eftersom primrarna konstruerats för att hitta ett bestämt smittämne.

Tack vare kopieringen kan PCR-metoden användas för att spåra mycket små mängder av smittämne i ett prov. Det finns flera sätt att påvisa den kopierade arvsmassan, DNA, men i alla metoder används någon form av infärgning, där DNA märks med ett fluorescerande färgämne. Ett vanligt sätt är att PCR-maskinen är kopplad till en dator som visar resultatet i form av kurvor i ett diagram.

Patientproven och alla kemikalier som behövs sätts i en platta med plats för 96 prov. Denna platta placeras sedan i ett PCR-instrument där analysen utförs. Beroende på vilka agens som man vill analysera tar denna procedur mellan två och tre timmar.

Mycket har hänt sedan PCR-tekniken i slutet av 1980-talet gav molekylärbiologin en kraftig skjuts framåt. Ner till enstaka mikrober kan nu detekteras utan föregående odling. Det har heller ingen betydelse att bakterien, parasiten eller viruset inte längre är levande. Dessa kan detekteras ändå, så länge DNA eller RNA, nukleinsyra/arvsmassa, finns kvar i provet.

Därför har också PCR blivit standardmetodik på de flesta svenska laboratorier under de senaste åren.

 

När ska vi beställa pcr

Frågeställningar där PCR-metoder är betydelsefulla:

  • Om en bakterie, ett virus eller en parasit över huvud taget finns i provet, om så är fallet tyder detta på en aktuell infektion. Om det är ett virus som är orsaken till sjukdom kan man avstå från onödiga antibiotikabehandlingar.

  • Om en känd bakterie bär på en resistensgen; PCR används även för verifikation av vissa typer av resistens.

  • PCR följt av DNA-sekvensering av en gen som kodar för ett ribosomalt RNA, 16S rDNA, kan användas för identifiering av ovanliga bakterier. PCR kan även användas för att påvisa DNA från döda/icke-odlingsbara bakterier, varför 16S rDNA-sekvensering är en användbar metod när bakteriella agens misstänks men odlingar är negativa.

  • För att se om nivåer av virus sjunker hos patienter som behandlas med antivirala medel; t ex vid behandling av Hepatit B, C och HIV och därmed se om medicineringen fungerar eller ej. Detta gäller också patienter som har nedsatt immunförsvar, till exempel efter en transplantation, som ofta drabbas av reaktiveringar av olika herpesvirus som också är känsliga för vissa antivirala medel.

En PCR-analys innehåller flera tidskrävande steg och därför kan man inte förvänta sig att få ett provsvar lika snabbt som från klinisk kemi. Detta beror på att man inte kan analysera ett provmaterial direkt utan man måste först preparera och extrahera fram DNA eller RNA för att sedan utföra själva PCR-analysen. Denna extraktion tar mellan en och fyra timmar beroende på provmaterial. 

När får vi svar

I och med att utvecklingen har gått framåt de senaste åren kan man nu erbjuda svar samma dag som provet kommer till lab. Som exempel kan nämnas att för tio år sedan tog det nästan tre dygn att utföra en analys för vinterkräksjukan och idag kan man lämna ut ett svar redan efter 6-8 timmar. Detta förutsätter att provet finns labbet tillhanda före klockan 09.00 på morgonen.

Om så är fallet kan man förvänta sig ett svar senast klockan 17.00 på eftermiddagen.